Zadanie 4.2

Zadanie 4.2

Szczegółowy opis zakresu rzeczowego zadań w 2023r.:

Cel zadania: opracowanie skutecznych metod biotechnologicznych, wykorzystujących NPBT oraz wyprowadzenie z ich użyciem edytowanych linii zbóż udoskonalonych pod względem cech istotnych gospodarczo.

Celem długofalowym zadania, w perspektywie 3-4 lat, jest stworzenie efektywnego, wydajnego systemu, który pozwoli na edytowanie dowolnego genotypu pszenicy zwyczajniej i pszenżyta.  Celem badań w 2023 roku będzie optymalizacja dwóch wariantów tego systemu: 1) edytowanie zbóż na drodze Agro-transformacji; 2) edytowanie zbóż metodą bezwektorową na drodze mikrowstrzeliwania.

Część badań będzie kontynuacją prac podjętych w ubiegłym roku. Dotyczy to optymalizacji protokołów transformacji genetycznej i regeneracji in vitro roślin pszenicy i pszenżyta w celu przełamania problemu braku regeneracji u genotypów niepodatnych. Ponadto, w bieżącym roku testowane będą dwa nowe czynniki morfogenetyczne przełamujące niepodatność na regenerację, które zostaną wprowadzone do testowanych genotypów. Rozpoczniemy również prace nad zaprojektowaniem nowego, bezwektorowego systemu edycji zbóż.

Do celów zadania należy:

1. Zaprojektowanie i ocena skuteczności wektorów ekspresyjnych zawierających CRISPR/Cas oraz nowe czynniki morfogenetyczne.
2. Optymalizacja metod regeneracji in vitro i transformacji pszenicy i pszenżyta, w tym genotypów wskazanych przez spółki Grupy IHAR.
3. Zaprojektowanie i wdrażanie systemu bezwektorowej, ukierunkowanej mutagenezy genomu pszenicy metodą biolistyczną (mikrowstrzeliwania).

Opis zadania(rok 2023)
W 2023 roku badania zakładają optymalizację modyfikacji genetycznej roślin zbóż dwoma sposobami: 1) za pomocą Agro-transformacji oraz 2) opracowując pierwsze etapy metody bezwektorowej, ukierunkowanej mutagenezy genomu pszenicy metodą biolistyczną (mikrowstrzeliwania). W przypadku Agro-transformacji optymalizacja modyfikacji genetycznych będzie realizowana na dwa sposoby. Pierwszy to optymalizacja składu pożywek do regeneracji i transformacji roślin in vitro, zwiększająca wydajność lub przełamująca barierę braku zdolności do regeneracji odmian / linii hodowlanych niepodatnych w kulturach in vitro. W tym celu zaplanowano zakup spektrofotometru płytkowego, który będzie wykorzystywany m.in. do pomiarów stężenia kwasów nukleinowych, gęstości zawiesin szczepów bakteryjnych, oznaczania aktywności enzymatycznej, wydajności systemu antyoksydacyjnego i jego wpływu na zdolność regeneracji transformowanych roślin. Drugim sposobem optymalizacji jest wprowadzenie do wektorów ekspresyjnych CRISPR/Cas9 czynników morfogenetycznych, zwiększających zdolność do regeneracji in vitro i transformacji różnych genotypów. W przypadku metody biolistycznej zostanie podjęta próba zaimplementowania systemu bezwektorowego. Celem tej metody jest dostarczenie komponentów systemu do indukowanej mutagenezy z pominięciem wektora bakteryjnego oraz wektora plazmidowego jako nośnika fragmentu DNA. Przewagą tej metody nad Agro-transformacją jest pominięcie wektora jakim jest Agrobacterium tubefacjens, przyczyniającego się do indukcji ciągłego stresu w czasie transformacji wynikającego z obecności bakterii oraz metabolitów (toksyn) produkowanych przez bakterie w czasie kokultury. Akumulacja tych niekorzystnych czynników może powodować znaczące odgraniczenie w regeneracji niedojrzałych zarodków. Jednak podstawą tego systemu jest brak wektora plazmidowego i możliwość wprowadzania ukierunkowanych mutacji za pomocą kompleksów rybonukleinowych (RNP). Takie kompleksy wprowadza się do komórek rośliny przy użyciu strzelby genowej. Udokumentowano, że mogą one powodować edycję / ukierunkowaną mutację a uzyskane rośliny nie zawierają DNA jako nośnika informacji genetycznej, czyli nie są GMO.

Materiał roślinny wykorzystany w proponowanym zadaniu będą stanowiły odmiany i linie hodowlane dostarczone przez spółki z Grupy IHAR, a kontrolę odmiany modelowe, o znanej, wysokiej zdolności do regeneracji. Genem, który będzie podlegał ukierunkowanej mutagenezie jest gen wybrany przez Hodowców, tj. gen Mlo. Mutacje w tym genie powodują zwiększoną odporność roślin na choroby grzybowe.

Realizacja zadania w 2023 r. obejmie następujący zakres prac:

Optymalizacja metod Agro-transformacji:

1.  Zaprojektowanie i ocena skuteczności wektorów ekspresyjnych zawierających CRISPR/Cas oraz nowe czynniki morfogenetyczne.

1. Zaprojektowanie i skonstruowanie dwóch nowych wektorów ekspresyjnych (miernik) zawierających komponenty systemu CRISPR/Cas9 oraz różne czynniki morfogenetyczne przełamujące oporność na regenerację roślin w kulturach in vitro. Wektory zostaną użyte do transformacji genetycznej niedojrzałych zarodków pszenżyta.
2. Wysadzenie roślin z 4 genotypów pszenżyta w tym 2 genotypów modelowych oraz genotypów otrzymanych od hodowców (miernik), obejmujących formy jare i ozime celem pozyskania niedojrzałych zarodków.
3. Wykonanie trzech doświadczeń transformacji genetycznej z wykorzystaniem min. 400 niedojrzałych zarodków z każdego genotypu dla dwóch wektorów typu CRISPR/Cas9 i wektora kontrolnego, łącznie   4800 zarodków (miernik).

2.  Optymalizacja metod regeneracji in vitro genotypów pszenicy ozimej:

1. Wysadzenie 18 roślin z 6 genotypów hodowlanych (odmiany i rody) pszenicy ozimej (miernik) otrzymanych od Hodowców w trzech odstępach czasowych oraz 2 polskich jarych odmian kontrolnych.
2. Pobieranie niedojrzałych zarodków do badań (minimum 3 × 200 zarodków z każdego genotypu pszenicy ozimej = 3600) (miernik).
3. Optymalizacja składu pożywek do regeneracji roślin in vitro. W tym celu niedojrzałe zarodki będą wykładane na minimum sześć kombinacji pożywek (miernik). Będą one zawierały zoptymalizowany w pierwszym roku realizacji DC skład makro- i mikroelementów, witamin oraz zróżnicowany skład regulatorów wzrostu. Optymalizacja składu pożywek jest jednym z etapów optymalizacji całego protokołu regeneracji i transformacji in vitro.
4. Agro-transformacja niedojrzałych zarodków dwóch odmian konstruktem do edycji genów Mlo, uzyskanym w 2022 roku.

Niezależnie od wybranego sposobu optymalizacji modyfikacji genetycznych oceniana będzie wydajności regeneracji roślin, wydajność transformacji metodą Agro-transformacji oraz efektywności systemu CRISPR/Cas9 poprzez detekcję indukowanych mutacji w docelowym genie. Liczba analiz uzależniona jest od liczby uzyskanych roślin w kulturach in vitro.
Ze względu na ilość pracy oraz ograniczenie w powierzchni fitotronów optymalizacje składu pożywek (pszenica) oraz czynników morfogenetycznych (pszenżyto) będą wykonywane niezależnie.

Optymalizacja ukierunkowanej mutagenezy metodą bezwektorową:

1. Zaprojektowanie i wdrażanie systemu bezwektorowej, ukierunkowanej mutagenezy genomu pszenicy metodą biolistyczną (mikrowstrzeliwania).
2. Przygotowanie pierwszych elementów systemu bezwektorowego: 1) system syntezy in vitro sgRNA, 2) system uzyskiwania kompleksów nukleinobiałkowych (RNP) z Cas9 i sgRNA (mierniki).
3. Przygotowanie strzelby genowej do mikrowstrzeliwania. Przeprowadzenie pierwszych mikrowstrzeliwań w celu wstępnego opracowania warunków fizycznych.

Oczekiwane rezultaty zadania w 2023 roku:

1. Stworzenie wektora plazmidowego do edytowania genomu zbóż, zawierającego wybrany czynnik morfogenetyczny o największym potencjale regeneracji roślin w kulturach in vitro. W oparciu o opracowane protokoły przeprowadzona będzie edycja genów Mlo w 2 nowych genotypach pszenżyta.
2. Zoptymalizowanie protokołów regeneracji roślin in vitro i transformacji dla 6 ozimych odmian / rodów pszenicy. W oparciu o opracowane protokoły przeprowadzona będzie edycja genów Mlo w 2 genotypach pszenicy.
3. Zaprojektowanie dwóch pierwszych elementów systemu bezwekto-rowej, ukierunkowanej mutagenezy; zakup i uruchomienie strzelby genowej.