Zadanie 4.2

Cel zadania:

opracowanie skutecznych metod biotechnologicznych, wykorzystujących NPBT oraz wyprowadzenie z ich użyciem edytowanych linii zbóż udoskonalonych pod względem cech istotnych gospodarczo.

Celem długofalowym zadania, w perspektywie 3-4 lat, jest stworzenie efektywnego, wydajnego systemu, który pozwoli na edytowanie dowolnego genotypu pszenicy zwyczajniej i pszenżyta.  Celem badań w 2023 roku będzie optymalizacja dwóch wariantów tego systemu: 1) edytowanie zbóż na drodze Agro-transformacji; 2) edytowanie zbóż metodą bezwektorową na drodze mikrowstrzeliwania.

Część badań będzie kontynuacją prac podjętych w ubiegłym roku. Dotyczy to optymalizacji protokołów transformacji genetycznej i regeneracji in vitro roślin pszenicy i pszenżyta w celu przełamania problemu braku regeneracji u genotypów niepodatnych. Ponadto, w bieżącym roku testowane będą dwa nowe czynniki morfogenetyczne przełamujące niepodatność na regenerację, które zostaną wprowadzone do testowanych genotypów. Rozpoczniemy również prace nad zaprojektowaniem nowego, bezwektorowego systemu edycji zbóż.

W 2023 roku badania zakładają optymalizację modyfikacji genetycznej roślin zbóż dwoma sposobami: 1) za pomocą Agro-transformacji oraz 2) opracowując pierwsze etapy metody bezwektorowej, ukierunkowanej mutagenezy genomu pszenicy metodą biolistyczną (mikrowstrzeliwania). W przypadku Agro-transformacji optymalizacja modyfikacji genetycznych będzie realizowana na dwa sposoby. Pierwszy to optymalizacja składu pożywek do regeneracji i transformacji roślin in vitro, zwiększająca wydajność lub przełamująca barierę braku zdolności do regeneracji odmian / linii hodowlanych niepodatnych w kulturach in vitro. Drugim sposobem optymalizacji jest wprowadzenie do wektorów ekspresyjnych CRISPR/Cas9 czynników morfogenetycznych, zwiększających zdolność do regeneracji in vitro i transformacji różnych genotypów. W przypadku metody biolistycznej zostanie podjęta próba zaimplementowania systemu bezwektorowego. Celem tej metody jest dostarczenie komponentów systemu do indukowanej mutagenezy z pominięciem wektora bakteryjnego oraz wektora plazmidowego jako nośnika fragmentu DNA. Przewagą tej metody nad Agro-transformacją jest pominięcie wektora jakim jest Agrobacterium tubefacjens, przyczyniającego się do indukcji ciągłego stresu w czasie transformacji wynikającego z obecności bakterii oraz metabolitów (toksyn) produkowanych przez bakterie w czasie kokultury. Akumulacja tych niekorzystnych czynników może powodować znaczące odgraniczenie w regeneracji niedojrzałych zarodków. Jednak podstawą tego systemu jest brak wektora plazmidowego i możliwość wprowadzania ukierunkowanych mutacji za pomocą kompleksów rybonukleinowych (RNP). Takie kompleksy wprowadza się do komórek rośliny przy użyciu strzelby genowej.

Materiał roślinny wykorzystany w proponowanym zadaniu będą stanowiły odmiany i linie hodowlane dostarczone przez spółki z Grupy IHAR, a kontrolę odmiany modelowe, o znanej, wysokiej zdolności do regeneracji. Genem, który będzie podlegał ukierunkowanej mutagenezie jest gen wybrany przez Hodowców, tj. gen Mlo. Mutacje w tym genie powodują zwiększoną odporność roślin na choroby grzybowe.

Realizacja zadania w 2023 r. obejmie następujący zakres prac:

Optymalizacja metod Agro-transformacji:

1.  Zaprojektowanie i ocena skuteczności wektorów ekspresyjnych zawierających CRISPR/Cas oraz nowe czynniki morfogenetyczne.

1. Zaprojektowanie i skonstruowanie dwóch nowych wektorów ekspresyjnych (miernik) zawierających komponenty systemu CRISPR/Cas9 oraz różne czynniki morfogenetyczne przełamujące oporność na regenerację roślin w kulturach in vitro. Wektory zostaną użyte do transformacji genetycznej niedojrzałych zarodków pszenżyta.
2. Wysadzenie roślin z 4 genotypów pszenżyta w tym 2 genotypów modelowych oraz genotypów otrzymanych od hodowców (miernik), obejmujących formy jare i ozime celem pozyskania niedojrzałych zarodków.
3. Wykonanie trzech doświadczeń transformacji genetycznej z wykorzystaniem min. 400 niedojrzałych zarodków z każdego genotypu dla dwóch wektorów typu CRISPR/Cas9 i wektora kontrolnego, łącznie   4800 zarodków (miernik).

2.  Optymalizacja metod regeneracji in vitro genotypów pszenicy ozimej:

1. Wysadzenie 18 roślin z 6 genotypów hodowlanych (odmiany i rody) pszenicy ozimej (miernik) otrzymanych od Hodowców w trzech odstępach czasowych oraz 2 polskich jarych odmian kontrolnych.
2. Pobieranie niedojrzałych zarodków do badań (minimum 3 × 200 zarodków z każdego genotypu pszenicy ozimej = 3600) (miernik).
3. Optymalizacja składu pożywek do regeneracji roślin in vitro. W tym celu niedojrzałe zarodki będą wykładane na minimum sześć kombinacji pożywek (miernik). Będą one zawierały zoptymalizowany w pierwszym roku realizacji DC skład makro- i mikroelementów, witamin oraz zróżnicowany skład regulatorów wzrostu. Optymalizacja składu pożywek jest jednym z etapów optymalizacji całego protokołu regeneracji i transformacji in vitro.
4. Agro-transformacja niedojrzałych zarodków dwóch odmian konstruktem do edycji genów Mlo, uzyskanym w 2022 roku.

Niezależnie od wybranego sposobu optymalizacji modyfikacji genetycznych oceniana będzie wydajności regeneracji roślin, wydajność transformacji metodą Agro-transformacji oraz efektywności systemu CRISPR/Cas9 poprzez detekcję indukowanych mutacji w docelowym genie. Liczba analiz uzależniona jest od liczby uzyskanych roślin w kulturach in vitro.

Ze względu na ilość pracy oraz ograniczenie w powierzchni fitotronów optymalizacje składu pożywek (pszenica) oraz czynników morfogenetycznych (pszenżyto) będą wykonywane niezależnie.