Zadanie 3.17

Zadanie 3.17

Szczegółowy opis zakresu rzeczowego zadań w 2023r.:

Opis zadania (w roku 2023 nie są planowane wyjazdy zagraniczne):
I.IV-XII. 2023. Opracowanie modelu statystycznego sposobu łączenia prób pobranych z bulw.
Etap pierwszy: Opracowanie modelu zależności pomiędzy licznością próby, oczekiwanym wynikiem oceny typu „true-positive” (TP), a jakością oceny – błędem oceny w stosunku do populacji generalnej. Model zostanie opracowany na podstawie znajomości rozkładów zmiennych losowych odpowiadających uzyskiwanym wynikom przy założonym poziomie rezultatu TP i określonej liczności próby. Opracowany model będzie porównany z stosowanymi na świecie i proponowanymi w literaturze naukowej rozwiązaniami pozwalającymi na oszacowanie wielkości próby do potrzeb analiz laboratoryjnych (w tym ISTA SeedCalc, itp.).
Etap drugi: Pierwszym krokiem będzie weryfikacja opracowanego modelu i ocenianych metod w oparciu o posiadane dane rzeczywiste (ocena w ograniczonym zakresie ze względu na ilość dostępnych danych). Drugim krokiem będzie weryfikacja opracowanego modelu i testowanych metod w oparciu o dane symulacyjne (ocena w szerokim zakresie). Efektem końcowym będzie odpowiedź jaka powinna być optymalna wielkość próby.
Ocena liczności próby wykonana zostanie w oparciu o znane wzory i prawidłowości. Na tej podstawie wyznaczone zostaną krzywe pozwalające dobrać stosowną liczność próby przy założonym poziomie porażenia. Krytyczne będzie tu najwyższe możliwe porażenie – dla tego wariantu liczność próby będzie najwyższa. Na tak wyznaczonej teoretycznie liczności próby wykonane zostaną analizy laboratoryjne.
Dokładna ocena liczności próby post-hoc będzie wykonana po uzyskaniu wyników oznaczeń laboratoryjnych. Na podstawie rzeczywistych wyników oszacowana zostanie zmienność (wariancja) porażenia w badanej populacji (badanych populacjach), a następnie zostanie przeprowadzona analiza mocy testu dla jednostronnego testu t-Studenta przy założonej normie odpowiadającej kolejnym stopniom porażenia. Na tej podstawie zostanie stwierdzone empirycznie czy określone teoretycznie liczności próby są wystarczające do stwierdzenia przekroczenia (lub nie) określonych progów porażenia.

II.IV-VII. 2023. Wyznaczanie parametrów analitycznych metody. Ilościowa analiza metody. Dla wirusów Y, L, M, S, X i A ziemniaka zostaną zaprojektowane i zamówione w firmie zewnętrznej dwuniciowe wzorce DNA zawierające regiony genomów amplifikowanych przez specyficzne zestawy starterów i sond. W regionie poprzedzającym sekwencję danego patogenu wstawiony zostanie promotor rozpoznawany przez dsDNA-zależną polimerazę RNA faga T7. Takie konstrukty dsDNA posłużą do syntezy in vitro jednoniciowych RNA o sekwencjach identycznych z fragmentami genomu wirusów. Uzyskane preparaty RNA będą izolowane z mieszaniny reakcyjnej i zostanie oznaczona ich koncentracja za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego (spektrofotometr Epoch, Biokom) i fluorymetrycznego (fluorymter Qubit, ThermoFisher Scientific). Długość fragmentów RNA zostanie potwierdzona za pomocą elektroforezy. Obliczona zostanie liczba kopii RNA w uzyskanych preparatach. Preparaty RNA będą mieszane z RNA izolowanym z bulw zdrowych w celu uzyskania prób o znanej liczbie kopii, które posłużą do przygotowania krzywych kalibracyjnych. Za pomocą krzywych wyznaczone zostaną następujące parametry:

1. Zakres liniowy metody - zakres rozcieńczeń w którym wartość Cq jest wprost proporcjonalna do liczby kopii RNA zgodnie z równaniem y=ax+b, gdzie y = Cq, a = nachylenie krzywej, x = logarytm dziesiętny z liczby kopii RNA, b = punkt przecięcia krzywej z osią Y.
2. Wydajność amplifikacji – wyznaczane z nachylenie krzywej (a). Parametr a o wartości -3,32 odpowiada 100% wydajności.
3. Granica oznaczalności (LOQ, limit of quantification) - najmniejsza liczba kopii RNA patogenu jaką można oznaczyć ilościowo z akceptowalnym poziomem precyzji i dokładności. Odpowiada najmniejszej liczbie kopii wyznaczanej z krzywej (najwyższa wartość Cq w zakresie liniowym krzywej).
4. Granica wykrywalności (LOD, limit of detection) – najmniejsza liczba kopii RNA patogenu, możliwa do wykrycia w sposób nie podlegający wątpliwości, lecz niekoniecznie możliwa do oznaczenia ilościowego, znajdująca się poza dolnym zakresem liniowym krzywej kalibracyjnej.

   Jakościowa analiza metody. Przeprowadzone zostaną co najmniej trzy eksperymenty z rozcieńczeniami ekstraktów dla każdego z badanych patogenów i analizowanych parametrów. Ekstrakty z patogenem będą rozcieńczane ekstraktami ze zdrowych bulw. W celu uzyskania wiarygodnych wyników testu multiplex RT-qPCR, będą stosowane następujące kontrole dla każdej serii ekstrakcji RNA i amplifikacji odpowiednio docelowego patogenu i docelowego genomowego RNA: negatywna kontrola izolacji (negative isolation control, NIC), negatywna kontrola amplifikacji (negative amplification control, NAC), pozytywna wewnętrzna kontrola izolacji (positive internal control, PIC - w tym celu amplifikowany będzie gen COX) oraz pozytywna kontrola amplifikacji (positive amplification control, PAC - wzorcowe RNA dla danego patogena). Wyznaczane będą następujące parametry:

5. Względna czułość analityczna. Określone zostanie maksymalne rozcieńczenie homogenatu z bulw, w którym możliwe jest wykrycie badanych patogenów na podstawie trzech niezależnie przygotowanych serii rozcieńczeń.
6. Selektywność analityczna. Porównanie wyników badania na różnych odmianach sadzeniaka ziemniaka o znanym porażeniu.
7. Specyficzność analityczna. W ramach badania ekskluzywności - oceniona zostanie zdolność poszczególnych zestawów starterów i sond do niespecyficznej amplifikacji RNA. W tym celu do izolacji RNA zostaną wykorzystane ekstrakty z bulw zawierające jedynie RNA poszczególnych patogenów. Po izolacji RNA każdego patogenu będzie amplifikowane za pomocą każdego zestawu starterów i sond stosowanych w metodzie. W celu oceny inkluzywności, z zewnętrznego banku patogenów zostaną zakupione po trzy warianty (szczepy, izolaty) każdego z badanych patogenów.

   Badana będzie zdolność specyficznych zestawów starterów i sond do wykrycia różnych izolatów/szczepów danego patogenu.

8. Powtarzalność. Co najmniej trzy powtórzenia ekstraktów z bulw o względnie niskiej liczbie kopii RNA zostaną przebadane przez tę samą osobę i w tym samym reżimie izolacji i amplifikacji RNA.
9. Odtwarzalność. Co najmniej trzy powtórzenia ekstraktów z bulw o względnie niskiej liczbie kopii RNA zostaną przebadane przez różne osoby i na różnych termocyklerach czasu rzeczywistego.

II.IV-IX. Przygotowanie bulw zainfekowanych badanymi wirusami w doświadczeniu polowym. Wykonane zostanie doświadczenie polowe, w którym wysadzone zostanie po 300 bulw odmian Jurek i Vineta. Bulwy zostaną przygotowane z wolnych od patogenów roślin in vitro uzyskanych z Banku Genów Ziemniaka. W celu zapewnienia warunków prowokacyjnych bezpośrednio przy poletku z tymi odmianami wysadzone zostanie poletko „infekcyjne”, na którym wysadzone zostanie po 20 bulw sadzeniaków ziemniaka zainfekowanych odpowiednio wirusami L, Y, M, S, A i X. Rośliny badane i infektory będą badane testem DAS-ELISA w okresie kwitnienia w celu oceny skuteczności infekcji. W razie potrzeby wykonane zostanie infekowanie mechaniczne sokiem zawierającym badane wirusy. Bulwy zostaną zebrane i zmagazynowane w przechowalni we wrześniu. Z bulw pobrane zostaną fragmenty tkanki, które będą przechowywane w -80C do dalszych badań. Po ustaleniu sposobu łączenia prób (bulkowania), zebrane próby zostaną przebadane metodą 1:1 oraz za pomocą bulkowania. Z bulw wolnych od wirusów i o potwierdzonych infekcjach wirusowych osobno wyciśnięty zostanie sok do dalszych badań, w tym sporządzenia zestawów prób symulujących procent porażenia wirusami w okolicach wartości progowych.
V.IV-XII. Ocena skuteczności wykrywania wirusów w bulwach metodą łączenia prób (bulkowania). Na podstawie opracowanego modelu (pkt. 1) zostanie wskazana oczekiwana ilości bulw w próbie z uwzględnieniem sposobu ich dzielenia na podpróby. Przeprowadzona zostanie również statystyczna analiza prób badanych metodą 1:1 o znanym porażeniu, będącym na granicy poziomu zawirusowania określonego dla kategorii oraz stopni kwalifikacji (klas o symulowanym porażeniu wirusami zbliżonym do granic 0,5; 1, 2, 4, 8 i 10%) sadzeniaków ziemniaka. Uzyskane wyniki zostaną porównane z analogicznymi dla tej samej próby połączonej w podpróby.

Spodziewany wymierny efekt realizacji zadania.
Wymiernym efektem realizacji zadania będzie modyfikacja metody molekularnej wykrywania wirusów ziemniaka za pomocą multipleks RT-PCR w czasie rzeczywistym w sposób umożliwiający sprawdzenie wymagań określonych w przepisach UE dla sadzeniaków ziemniaka. Ponadto przygotowane zostaną dane empiryczne i metody analiz statystycznych, na podstawie których, będzie można zastosować metodę multipleks real-time RT-PCR w rutynowych badaniach prowadzonych przez PIORiN.