Zadanie 4.2

Wykonawcy (tylko naukowi):

• prof. dr hab. A. Nadolska-Orczyk
• dr M. Przyborowski
• dr U. Piechota
• dr P. Słowacki
• mgr K. Michalski

Szczegółowy opis zakresu rzeczowego zadań w 2022 r.:

Celem zadania jest opracowanie skutecznych metod biotechnologicznych, wykorzystujących NPBT oraz wyprowadzenie z ich użyciem edytowanych linii zbóż udoskonalonych pod względem cech istotnych gospodarczo.

Cel zadania (rok 2022):

1. Zaprojektowanie i ocena skuteczności wektorów opartych o CRISPR/Cas do edytowania genomu pszenicy i pszenżyta w tym wskazanych przez Spółki Hodowli Roślin linii hodowlanych pszenicy;
2. Opracowanie metod regeneracji in vitro pszenicy, w tym genotypów wskazanych przez Spółki Hodowli Roślin.

Opracowanie wydajnej metody oceny konstruktów gRNA/Cas9 w systemie zawiesinowym pszenicy.

Opis zadania (rok 2022)

W ramach zadania, obok genotypów o potwierdzonej wysokiej skuteczności stosowania NPBT, będą użyte zaawansowane linie hodowlane pszenicy i pszenżyta udostępnione przez spółki Grupy IHAR, odporne na regenerację in vitro, u których zastosowanie NPBT wymagało będzie optymalizacji lub modyfikacji istniejących procedur. Opracowany zostanie uniwersalny system oceny konstruktów dla pszenicy.

Realizacja zadania w 2022 r. obejmie następujący zakres prac podzielony na 3 bloki tematyczne:

BLOK I – wykonawca ZGF

Optymalizacja metod uzyskiwania roślin pszenicy o zmienionej cesze

Opis realizacji zadania w ramach bloku I

1. Wysadzenie po 24 roślin z 6 genotypów pszenicy: 4 genotypów hodowlanych wskazanych przez hodowców oraz 2 polskich odmian kontrolnych w dwóch odstępach czasowych (razem 288 roślin).
2. Pobieranie niedojrzałych zarodków do badań (minimum 2 × 200 zarodków z każdego genotypu) (miernik).
3. Optymalizacja składu pożywek do regeneracji roślin in vitro.
   W tym celu niedojrzałe zarodki będą wykładane na będą dwie kombinacje pożywek, zawierające zoptymalizowane składy makro- i mikroelementów, witamin i regulatorów wzrostu (miernik). Optymalizacja składu pożywek jest jednym z etapów optymalizacji całego protokołu regeneracji in vitro.
4. Przygotowanie i testowanie konstruktów genetycznych w szczepach Agrobacterium.
   W celu zwiększenia podatności genotypów na transformację genetyczną przygotowane będą i przetestowane na tym samym materiale roślinnym dwa różne konstrukty genetyczne w dwóch szczepach Agrobacterium (miernik). Będą to szczepy AGL1 oraz EHA105 dedykowane m.in. do transformacji zbóż. Oceniana będzie zdolność do regeneracji in vitro i transformacji genetycznej badanych genotypów. W kolejnych latach zarówno liczby testowanych genotypów hodowlanych pszenicy, jak i liczby uzyskiwanych roślin modyfikowanych znacząco wzrosną.

BLOK II – wykonawca ZGF, ZBS

Opracowanie autorskich metod uzyskiwania roślin pszenżyta o zmienionej cesze

Opis realizacji zadania w ramach bloku II

1. Wysadzenie roślin dwóch polskich odmian pszenżyta, jednej odmiany jarej i jednej ozimej (miernik) celem pozyskania niedojrzałych zarodków.
2. Wykonanie trzech doświadczeń transformacji genetycznej z wykorzystaniem 400 niedojrzałych zarodków obu odmian dla każdego wektora, łącznie 2400 zarodków (miernik).
3. Skonstruowanie dwóch wektorów ekspresyjnych (miernik) zawierających komponenty systemu CRISPR/Cas9 oraz różne regulatory wzrostu przełamujące oporność na regenerację roślin in vitro i jeden wektor kontrolny nie zawierający tych regulatorów. Wektory zostaną użyte do transformacji genetycznej niedojrzałych zarodków pszenżyta.
4. Testowanie efektywności zaprojektowanych wektorów ekspresyjnych w liniach kalusowych uzyskanych po transformacji genetycznej. Badania obejmą analizę ekspresji wprowadzonych genów oraz ocenę wydajności regeneracji roślin. Ponadto, badana będzie efektywność systemu CRISPR/Cas9 poprzez detekcję indukowanych mutacji w docelowym genie.

Opracowany w ten sposób system edytowania i regeneracji roślin zostanie wykorzystany w kolejnych latach do modyfikacji zaawansowanych linii hodowlanych pszenżyta.

BLOK III -wykonawca LKGMO

Opracowania metody oceny efektywności edycji gRNA przed zastosowaniem ich do edycji genomów in planta.

Opis realizacji zadania w ramach bloku III

Laboratorium Kontroli GMO dysponuje zawiesinami pszenicy, jęczmienia oraz żyta uzyskanymi podczas realizacji tematów badawczych w latach 2016-2020. Realizując jeden z tematów Dotacji Statutowej IHAR 2021 zoptymalizowany został system oceny konstruktów oparty o protoplasty uzyskiwane z zawiesiny jęczmienia. W założeniu, system ten charakteryzuje się stabilną ekspresją białkowej (Cas9) części systemu CRISPR co, w odróżnieniu od rutynowych metod transfekcji, pozwala na uzyskanie bardziej miarodajnych wyników oceny wydajności konstruktu. Analogicznie, dla celów zadania, zoptymalizowany i zwalidowany zostanie system oparty o zawiesinę pszeniczną. System zakłada izolację protoplastów z zawiesiny wykazującej aktywną ekspresję białka Cas9 oraz dostarczanie do nich (transfekcję) prostych plazmidów zawierających oceniany gRNA oraz markerowy gen zielonej fluorescencji (GFP). Następnie, przy pomocy fluorescencyjnego licznika komórek, wydajność procesu transfekcji oraz żywotność protoplastów będzie oceniana poprzez wysokoprzepustowe obrazowanie sygnału GFP. Uzyskana wydajność transfekcji posłuży ostatecznie do obliczenia całkowitej wydajności ocenianych gRNA. Zaplanowane prace obejmą:

1. Przygotowanie minimum 5 konstruktów CRISPR/Cas9 (miernik), które poddane zostaną ocenie w nowo opracowanym systemie. Konstrukty, które będą charakteryzować się wysoką wydajnością edytowania genów, wykorzystane zostaną na dalszych etapach realizacji projektu.
2. Opracowanie wysoko wydajnej metody, służącej do szybkiej oraz wiarygodnej oceny efektywności edytowania zaprojektowanego gRNA przed zastosowaniem ich do edytowania genów pszenicy in planta.