Zadanie 4.4

Zadanie 4.4

Szczegółowy opis zakresu rzeczowego zadań w 2025r.:

Rdza żółta (Puccinia striiformis f.sp. tritici) jest jednym z najgroźniejszych patogenów pszenicy, powodującym znaczne straty w plonach na całym świecie. Skutkuje to istotnymi stratami ekonomicznymi w sektorze rolnym i wpływa na globalne bezpieczeństwo żywnościowe. Szybkie tempo ewolucji nowych ras patogenu zdolnych do przełamywania odporności uwarunkowanej istniejącymi genami, wymusza konieczność opracowywania nowych odmian pszenicy o trwałej odporności na infekcję tego gatunku grzyba.
Ukierunkowana mutageneza genów kandydujących stanowi obecnie obiecującą metodę zwiększania odporności pszenicy na rdzę żółtą. Wykorzystanie technik precyzyjnej edycji genów pozwala na poszerzenie puli zmienności genetycznej warunkującej odporność oraz znaczące przyspieszenie procesu hodowlanego. Podejście to, w połączeniu z narzędziami inżynierii genetycznej, daje szansę na uzyskanie bardziej stabilnych i odpornych odmian pszenicy, które będą w stanie skuteczniej sprostać wyzwaniom związanym z dynamicznymi zmianami środowiskowymi i epidemiologicznymi.

Cele szczegółowe zadania:

1. Przegląd literatury i opracowanie bioinformatyczne genów kandydujących do ukierunkowanej mutagenezy w celu uzyskania odporności na rdzę żółtą.
2. Przygotowanie konstruktów i ich weryfikacja w gatunku modelowym – jęczmieniu.
3. Optymalizacja metod regeneracji i transformacji genotypów pszenicy o niskiej odporności na rdzę żółtą wskazanych przez Hodowców.
4. Optymalizacja metod regeneracji i transformacji genotypów pszenicy o niskiej odporności na rdzę żółtą wskazanych przez Hodowców.
5. Testowanie funkcjonalności konstruktów w modelowych odmianach pszenicy i pierwsze próby wprowadzenia do linii hodowlanych wskazanych przez Hodowców.
6. Selekcja potencjalnie transgenicznych roślin.
7. Wybór panelu genotypów pszenic o zróżnicowanym pochodzeniu i ich ocena fenotypowa pod kątem odporności na rdzę żółtą.
8. Sekwencjonowanie i analiza bioinformatyczna locus Yr5 oraz analiza ekspresji homeologów genu w wybranych genotypach w celu ustalenia możliwości edytowania i uzyskania odporności na rdzę żółtą w pszenicy.

Opis zadania:

BLOK I – wykonawca Zakład Genomiki Funkcjonalnej (ZGF)
Opracowanie systemu CRISPR/Cas oraz metod regeneracji i transformacji do otrzymywania ukierunkowanych mutacji warunkujących odporność na rdzę żółtą w materiałach hodowlanych pszenicy.

Zakres prac:

1. Szczegółowy przegląd literatury naukowej. Wybranie genu kandydującego do ukierunkowanej mutagenezy w celu uzyskania potencjalnie szerokiego spektrum odporności na rdzę żółtą.
2. Charakterystyka bioinformatyczna genu kandydującego i konstrukcja wektorów. Przygotowanie wektorów do ukierunkowanej mutagenezy.
3. Testowanie funkcjonalności konstruktów w gatunku modelowym – jęczmieniu. Przeprowadzenie testów funkcjonalności z wykorzystaniem jęczmienia (30 zarodków × 2 wektory × 2 powtórzenia).
4. Testowanie funkcjonalności konstruktów w modelowych odmianach pszenicy. Weryfikacja działania konstruktów w dwóch odmianach pszenicy (80 zarodków × 2 wektory × 2 powtórzenia).
5. Optymalizacja metod regeneracji i transformacji dla 3 wskazanych przez Hodowców genotypów pszenicy o niskiej odporności na rdzę żółtą: wysadzenie roślin w dwóch terminach, wyłożenie niedojrzałych zarodków z 3 genotypów na 4 kombinacje pożywek do regeneracji in-vitro (po 50 zarodków x 4 kombinacje x 3 genotypy x 2 wektory = 1200 zarodków), wybór najlepszej kombinacji pożywek dla każdego genotypu.
6. Selekcja potencjalnie transgenicznych roślin.

BLOK II – wykonawca Zakład Biologii Stosowanej (ZBS)
Analiza molekularna i fitopatologiczna panelu genotypów pszenic pod kątem możliwości wprowadzenia odporności na rdzę żółtą warunkowaną Yr5 do materiałów hodowlanych pszenicy za pomocą ukierunkowanej mutacji.

Zakres prac:

1. Opracowanie literaturowe i bioinformatyczne miejsc targetowych genu Yr5 potencjalnie warunkujących podwyższenie odporności na rdzę żółtą.
2. Wybór panelu genotypów pszenic o zróżnicowanym pochodzeniu, w tym materiałów wskazanych przez zainteresowanie spółki hodowli roślin, genotypów pochodzących ze światowych kolekcji, genotypów wzorcowych. [192 genotypy].
3. Ocena fenotypowa (testy fitopatologicznczne) badanych genotypów. [192 genotypy + zestaw różnicujący].
4. Izolacja DNA i analiza locus Yr7+Yr5/SP w badanych genotypach z użyciem zastawu markerów typu AS-PCR [192 genotypy]. Selekcja genotypów do sekwencjonowania locus Yr5.
5. Optymalizacja amplifikacji locus Yr5 [80 genotypów]. Sekwencjonowanie Yr5 w genotypach, dla których uzyskano produkty PCR zgodne z oczekiwaniem. Identyfikacja bioinformatyczna danych po sekwencjonowaniu i selekcja genotypów do analizy ekspresji Yr5.
6. Izolacja RNA z wyselekcjonowanych genotypów w czasie trwania infekcji Puccinia striiformis. Opracowanie starterów do ilościowego PCR. Ocena poziomu ekspresji genu pod wpływem patogenu.
7. Opracowanie założeń strategii modyfikacji genetycznej pszenicy podnoszącej odporność na rdzę żółtą warunkowaną Yr5.