Zadanie 4.9
| Tytuł projektu: | Racjonalizacja wyboru genów kandydujących powiązanych z androgenezą żyta do edycji genomowej. |
| Kierownik projektu: | dr hab. R. Orłowska prof. Instytutu |
Szczegółowy opis zakresu rzeczowego zadań w 2025r.:
Cel zadania: Oszacowanie wydajności uzyskiwania regenerantów żyta (Secale cereale L.)
w kulturach pylnikowych w zmiennych warunkach prowadzenia hodowli in vitro.
Opracowanie konstruktów genowych umożliwiających wprowadzenie modyfikacji w obrębie genów odpowiedzialnych za cechy przydatne w hodowli stanowi jeden z etapów usprawniających proces hodowlany. Wykorzystywanie nowych technik genomowych (NGT), bez wytypowania genów kandydujących oraz bez zrozumienia, dlaczego taki, a nie inny, gen ma być modyfikowany jest bezużyteczne. Wybór genu lub określonej sekwencji, do edycji tylko w oparciu o literaturę, bez weryfikacji użyteczności potencjalnej sekwencji na szerszej puli genowej, może być obciążony błędem i prowadzić do nieuzasadnionych nakładów finansowych. Podobnie, stosowanie danych eksperymentalnych (np. wyników analizy transkryptomicznej) opartych na próbach skrajnych (androgeniczne / nieandrogeniczne, odporne / nieodporne), ogranicza typowanie genów tylko do zmienności reprezentowanej przez skrajne genotypy. Pozornie „silne” geny mogą być nieistotne w odniesieniu do szerszej puli genowej gatunku. W rezultacie nakłady poniesione na edycję będą generowały straty. Dlatego ważne jest opracowanie racjonalnego podejścia do wyboru sekwencji do edycji w oparciu o zróżnicowaną pulę genotypów danego gatunku. Takie podejście umożliwi minimalizację nakładów na prace genetyczne oraz uzasadni decyzję o wyborze określonego genu do edycji. Ma to szczególne znaczenie, gdy dana cecha jest ściśle powiązana z genotypem lub jest wielogenowa, jak to ma miejsce w przypadku androgenezy u żyta. Dlatego też, u regenerantów żyta z różnych genotypów będą identyfikowane metabolity poszczególnych szlaków biochemicznych, powiązane z wydajnością androgenezy oraz z wydajnością regeneracji roślin zielonych i albinotycznych. Zróżnicowanie poziomu metabolitów będzie wynikiem działania kofaktorów reakcji enzymatycznych, dodawanych do pożywek indukujących stosowanych w kulturach in vitro. Zostaną także oszacowane zmiany genetyczne i epigenetyczne w DNA uzyskanych regenerantów w kontekście odpowiedzi androgenicznej, gdyż czynniki epigenetyczne wydają się być równie istotne w procesie androgenezy u żyta.
W przypadku gdy uzyskane zmiany metabolitów lub różnice w zmienności genetycznej i epigenetycznej zostaną powiązane z androgenicznością żyta, będą one stanowiły podstawę do typowania genów kandydujących do edycji genowej, z jednoczesnym wskazaniem, które konkretnie sekwencje należy modyfikować lub też uzasadnieniem czy takie działania są opłacalne.
Opracowanie konstruktów genowych umożliwiających wprowadzenie modyfikacji w obrębie genów odpowiedzialnych za cechy przydatne w hodowli stanowi jeden z etapów usprawniających proces hodowlany. Wykorzystywanie nowych technik genomowych (NGT), bez wytypowania genów kandydujących oraz bez zrozumienia, dlaczego taki, a nie inny, gen ma być modyfikowany jest bezużyteczne. Wybór genu lub określonej sekwencji, do edycji tylko w oparciu o literaturę, bez weryfikacji użyteczności potencjalnej sekwencji na szerszej puli genowej, może być obciążony błędem i prowadzić do nieuzasadnionych nakładów finansowych. Podobnie, stosowanie danych eksperymentalnych (np. wyników analizy transkryptomicznej) opartych na próbach skrajnych (androgeniczne / nieandrogeniczne, odporne / nieodporne), ogranicza typowanie genów tylko do zmienności reprezentowanej przez skrajne genotypy. Pozornie „silne” geny mogą być nieistotne w odniesieniu do szerszej puli genowej gatunku. W rezultacie nakłady poniesione na edycję będą generowały straty. Dlatego ważne jest opracowanie racjonalnego podejścia do wyboru sekwencji do edycji w oparciu o zróżnicowaną pulę genotypów danego gatunku. Takie podejście umożliwi minimalizację nakładów na prace genetyczne oraz uzasadni decyzję o wyborze określonego genu do edycji. Ma to szczególne znaczenie, gdy dana cecha jest ściśle powiązana z genotypem lub jest wielogenowa, jak to ma miejsce w przypadku androgenezy u żyta. Dlatego też, u regenerantów żyta z różnych genotypów będą identyfikowane metabolity poszczególnych szlaków biochemicznych, powiązane z wydajnością androgenezy oraz z wydajnością regeneracji roślin zielonych i albinotycznych. Zróżnicowanie poziomu metabolitów będzie wynikiem działania kofaktorów reakcji enzymatycznych, dodawanych do pożywek indukujących stosowanych w kulturach in vitro. Zostaną także oszacowane zmiany genetyczne i epigenetyczne w DNA uzyskanych regenerantów w kontekście odpowiedzi androgenicznej, gdyż czynniki epigenetyczne wydają się być równie istotne w procesie androgenezy u żyta.
W przypadku gdy uzyskane zmiany metabolitów lub różnice w zmienności genetycznej i epigenetycznej zostaną powiązane z androgenicznością żyta, będą one stanowiły podstawę do typowania genów kandydujących do edycji genowej, z jednoczesnym wskazaniem, które konkretnie sekwencje należy modyfikować lub też uzasadnieniem czy takie działania są opłacalne.
Cel zadania będzie realizowany poprzez:
- Wytypowanie i uzyskanie roślin donorowych żyta oraz ich wstępną charakterystykę molekularną.
- Założenie kultur pylnikowych żyta z wykorzystaniem różnych proporcji kofaktorów (jony metali) reakcji enzymatycznych w pożywkach indukujących.
- Wskazanie efektywności regeneracji dla testowanych wariantów pożywek.
Opis zadania:
- Uzyskanie roślin donorowych żyta (80 roślin, 3 genotypy) (źródło eksplantatów do procesu androgenezy w kulturach pylnikowych) oraz pozyskanie i zabezpieczenie materiałów (liście) z tych roślin do analiz molekularnych i biochemicznych.
- Zebranie kłosów z roślin donorowych i poddanie stresowi chłodu i głodu (ciemność) w celu przeprogramowania mikrospor ze szlaku gametofitowego na sporofitowy.
- Założenie kultur in vitro w różnych warunkach prowadzenia hodowli (3 genotypy żyta, 9 wariantów pożywki indukującej: kontrola i 8 wariantów testowych).
- Uzyskanie zregenerowanych roślin żyta w kulturach pylnikowych z 1-3 genotypów roślin donorowych.
- Ocena wydajności regeneracji żyta w zmiennych warunkach hodowli in vitro (9 parametrów).
- Opracowanie statystyczne wyników dotyczących wydajności uzyskiwania regenerantów żyta, wskazanie skrajnych warunków w odniesieniu do wydajności uzyskiwania regenerantów.
- Wstępna analiza molekularna roślin donorowych (izolacja DNA oraz wykonanie analiz techniką metAFLP, uzyskanie elektroforegramów).