Zadanie 4.5

Zadanie 4.5

Szczegółowy opis zakresu rzeczowego zadań w 2025r.:

Cele zadania na rok 2025:

1. Wytypowanie genu kandydującego do edycji w jęczmieniu, analiza bioinformatyczna oraz sekwencjonowanie a następnie synteza odpowiednich sgRNA.
2. Tworzenie kompleksów RNP oraz weryfikacja ich aktywności in vitro.
3. Wytypowanie odmiany jęczmienia do edycji. Wybór, na podstawie literatury, rodzajów eksplantatów i składów podłoży a następnie ich testowanie.
4. Przygotowanie kasety DNA kodującej Cas9 i sgRNA.
5. Testy biolistycznego wprowadzania kompleksów RNP i/lub DNA z kasetą zawierającą geny Cas9 i sgRNA (tj. kasetą kodującą komponenty kompleksu RNP) do wybranych eksplantatów/genotypów.

Obecnie zdecydowana większość strategii CRISPR/Cas edycji genomów roślin wykorzystuje transformację genetyczną przy użyciu Agrobacterium tumefaciens. Choć strategia ta jest wysoce wydajna w przypadku genotypów modelowych, jej głównym ograniczeniem jest silna zależność od genotypu edytowanej rośliny zarówno w procesie Agro-transformacji, jak i regeneracji in vitro. W praktyce oznacza to konieczność czasochłonnego testowania i optymalizacji warunków tych etapów pracy dla każdego genotypu. W niektórych przypadkach ustalenie optymalnej procedury przy użyciu Agrobacterium może być trudne lub niemożliwe. W związku z tym kluczowe znaczenie ma opracowanie takich metod edytowania genomu, które będą niezależne od genotypu rośliny.
Celem zadania jest kompleksowe opracowanie bezwektorowej strategii edytowania roślin uprawnych. Kluczową zaletą tej strategii jest brak konieczności stosowania Agrobacterium, co różni ją od tradycyjnych metod CRISPR/Cas. Dodatkową korzyścią jest potencjalna uniwersalność i niezależność od genotypu edytowanej rośliny. W ramach zadania zastosowane będą dwa warianty metody bezwektorowej: 1) z użyciem DNA kodującym Cas9 i sgRNA oraz 2) bez użycia DNA przy wykorzystaniu kompleksu rybonukleinobiałkowego RNP (Cas9-sgRNA).
Skuteczność bezwektorowej strategii oraz uzyskanie roślin NGT wymagają szczegółowej optymalizacji warunków każdego etapu tj. zaprojektowanie sgRNA do edycji wybranego genu, przygotowanie konstruktów DNA lub RNP, opłaszczanie nanocząsteczek złota DNA lub kompleksami RNP, wprowadzanie tych elementów na nośniku nanocząstek złota do komórek metodą biolistyczną oraz otrzymywanie roślin z oczekiwaną zmianą w docelowym regionie genomowego DNA. Warunkiem skuteczności tej strategii jest dobranie parametrów tak, aby wprowadzone do komórek RNP i/lub DNA zawierające kasetę kodującą komponenty RNP pozostały w formie natywnej i zainicjowały proces edycji oraz co najważniejsze, aby eksplantaty roślin poddane temu procesowi zregenerowały.

Opis zadania:

1. Wytypowanie genu do edycji w jęczmieniu, sekwencjonowanie miejsc docelowych w wybranych odmianach/genotypach, projektowanie gRNA oraz synteza sgRNA
2. Tworzenie kompleksów RNP Cas9-sgRNA oraz weryfikacja aktywności tych kompleksów in vitro (testy cięcia amplikonów, analiza na żelu).
3. Przygotowanie kasety DNA kodującej Cas9 i sgRNA.
4. Wytypowanie odmiany jęczmienia oraz eksplantatów do edycji, testowanie pożywek regeneracyjnych i ocena efektywności regeneracji.
5. Testy biolistycznego wprowadzania przygotowanych kompleksów RNP i/lub kasety kodującej komponenty RNP do wybranych eksplantatów.