Zadanie 4.2
| Tytuł projektu: | Przystosowanie narzędzi precyzyjnej edycji zasad DNA do systemu szybkiej oceny gRNA w kulturach zawiesinowych oraz opracowanie przesiewowej metody oceny dostępności chromatyny w komórkach jęczmienia. |
| Kierownik projektu: | dr Krzysztof Michalski |
Szczegółowy opis zakresu rzeczowego zadań w 2025r.:
Drugim celem na ten rok to wprowadzenie aktywnej kultury zawiesinowej dwóch kolejnych gatunków, tj. pszenżyta oraz kukurydzy.
Trzeci cel to próba zastosowania gRNA zaprojektowanych i ocenionych w roku 2023 do edycji genomy żyta in planta.
Opis zadania:
Zadania realizowane od 2022 roku pozwoliły na opracowanie wydajnej metody oceny aktywności nowych gRNA z zastosowaniem transformowanych zawiesin pszenicy, jęczmienia i żyta. Opracowano także nowatorskie podejście dostarczania wektorów plazmidowych do komórek na drodze elektroporacji, co nie jest rutynowo stosowane dla roślin. Pragnąc dalej rozwijać ten system, na rok 2024 planowane jest opracowanie wektorów kodujących precyzyjne narzędzia (tzw. CRISPR2.0) do edycji zasad DNA, które pozwalają nie tylko na generowanie, w wybranym regionie genomu, mutacji o nieznanym efekcie fenotypowym, ale także na kierunkowe podmienianie pojedynczych nukleotydów. Taki typ modyfikacji pozwala na wprowadzenie do rośliny wybranych alleli o pożądanym efekcie fenotypowym.
Podjęta w ubiegłym roku inicjatywa, mająca na celu opracowanie mapy dostępności (do edycji) chromosomowego DNA jęczmienia, także będzie kontynuowana. Do tej pory zastosowano technikę ATACseq, pozwalającą na identyfikację fragmentów DNA, które w danej tkance nie są na stałe związane z białkami. Na ten rok planowane jest uzupełnienie tych danych o wyniki z sekwencjonowania CHIPseq, które pozwoli na identyfikację regionów chromosomowych związanych z ”aktywnymi” nukleosomami (zawierającymi histon H3 acetylowany w pozycji K27). Ponadto, wykonana zostanie analiza metylacji samego DNA, która to jest silnie skorelowana z zamkniętą chromatyną.
Połączenie tych trzech zbiorów danych pozwoli na ustalenie, z dużą dokładnością, które regiony chromosomowe w zarodkach jęczmienia mogą być wydajnie edytowane przez CRISPR/Cas9.
Pragnąc stale rozwijać i dopracowywać narzędzia opracowane latach uprzednich, na rok 2024 postawiono także dwa kolejne cele. Po pierwsze, repertuar prowadzonych kultur zawiesinowych poszerzony zostanie o dwa kolejne gatunki. Na podstawie ubiegłorocznych konsultacji z hodowcami, wybrano pszenżyto i kukurydzę.
Jako ostatnie zadanie postanowiono podjąć próbę praktycznego wykorzystania gRNA opracowanego w roku ubiegłym. Planowane jest wprowadzenie min. 2 takich konstruktów do komórek żyta i próba regeneracji edytowanych roślin. Wydajność edycji in planta zostanie skonfrontowana w wynikami uzyskanymi w opracowanym systemie zawiesinowym, celem jego ostatecznej walidacji.