Zadanie 4.8
| Tytuł projektu: | Opracowanie metod, procedur i narzędzi biotechnologicznych umożliwiających modyfikację genów warunkujących cechy priorytetowe w hodowli roślin ziemniaka za pomocą Nowych Technik Genomowych. |
| Kierownik projektu: | dr hab. K. Treder |
Szczegółowy opis zakresu rzeczowego zadań w 2025r.:
Cel zadania: Głównym celem zadania jest przeprowadzenie prac przygotowawczych umożliwiających wykorzystanie NGT (nowych technik genomowych) w hodowli twórczej ziemniaka. Odmiana ziemniaka jest klonem rozmnażanym wegetatywnie. Dlatego prace skupione będą na transfekcji protoplastów kompleksem białka Cas9
z sgRNA bez stosowania wektorów. Modelowo do edycji wybrano geny, których modyfikacje u ziemniaka opisywano w literaturze naukowej, kodujące czynniki białkowe związane z odpornością ziemniaka na wirus Y ziemniaka (PVY) - warianty eukariotycznego czynnika inicjującego translację 4E (eIF4E) oraz gen kodujący czynnik transkrypcyjny CYCLIC DOF FACTOR 1 (StCDF1), związany między innymi z tolerowaniem suszy. W tym celu optymalizowany będzie proces przygotowania hodowli zawiesinowych protoplastów, sama procedura transfekcji oraz regeneracja roślin z transfekowanych protoplastów.
Opis zadania:
- Wytypowanie trzech genotypów ziemniaka charakteryzujących się wysoką zdolnością do regeneracji w oparciu o analizę danych uzyskanych z Kolekcji In Vitro Ziemniaka Tetraploidalnego (IHAR-PIB, Oddział w Boninie) na temat regeneracji odmian utrzymywanych w kolekcji w trakcie wyprowadzania z kultur merystemowych i pasażowania eksplantatów.
- Analiza in silico sekwencji genów kodujących warianty eukariotycznego czynnika inicjującego translację 4E (eIF4E) oraz czynnika transkrypcyjnego CYCLIC DOF FACTOR 1 (StCDF1) w genotypach ziemniaka.
- Projektowanie starterów do amplifikacji sekwencji dwóch wybranych genów. Walidacja reakcji PCR (optymalizacja składu reakcji, analiza wydajności amplifikacji za pomocą zaprojektowanych starterów).
- Weryfikacja sekwencji obu czynników w trzech wybranych genotypach ziemniaka poprzez amplifikację techniką PCR i sekwencjonowanie produktu amplifikacji.
- Projektowanie sgRNA dla dwóch wybranych genów. Synteza in vitro sgRNA, tworzenie kompleksów z białkiem Cas9 i analiza in vitro aktywności kompleksu wobec docelowych sekwencji DNA przygotowanych za pomocą reakcji PCR.
- Optymalizacja przygotowywania kultur zawiesinowych protoplastów ziemniaka z wybranych genotypów.
- Optymalizacja procesu transfekcji protoplastów kompleksem sgRNA z białkiem Cas9.
- Optymalizacja procesu regeneracji roślin z protoplastów.