Zadanie 4.3
Tytuł projektu: | Opracowanie efektywnej regeneracji in vitro roślin jęczmienia ozimego dla materiałów hodowlanych polskich hodowców – przygotowanie do ukierunkowanej mutagenezy (NGT). |
Kierownik projektu: | dr Yuliya Kloc |
Szczegółowy opis zakresu rzeczowego zadań w 2025r.:
Opis zadania:
Badania obejmują opracowanie i optymalizację protokołów kultury in vitro i regeneracji roślin z niedojrzałych zarodków jęczmienia ozimego dla wybranych genotypów, wymagających specyficznych dostosowań. Proponowane badania umożliwią optymalizację składu pożywek, co pozwoli na stworzenie najbardziej efektywnych warunków regeneracji.
Poszczególne etapy:
Etap I: Jarowizacja roślin jęczmienia ozimego.
uprawa roślin w kontrolowanych warunkach fitotronowych do stadium niedojrzałych zarodków.
Etap II: Kultura wstępna.
- Izolacja i sterylizacja ziarniaków (Schemat 1).
- Przygotowanie trzech rodzajów pożywek do kultury wstępnej: KW1, KW2, KW3 z indywidualnie dobranym składem, różniących się stężeniem i proporcją regulatorów wzrostu (Dicamba, 2,4-D). Ich stężenie i proporcje są starannie dobierane, aby wspierać określone etapy wzrostu roślin, takie jak indukcja kalusa, różnicowanie tkanek czy regeneracja całych roślin z kalusa.
- Izolacja ok. 2880 niedojrzałych zarodków z wysterylizowanych ziarniaków z 8 genotypów jęczmienia (po 360 zarodków/genotyp, Schemat 1).
- Kultura in vitro ok. 120 zarodków na każdą z pożywek KW1, KW2, KW3 (3 kombinacje zgodnie z Schematem 2). Warunki kultury: kontrolowane warunki, w ciemności, w temperaturze 23 ºC.
Etap III: Formowanie kalusa embriogenicznego
- Przygotowanie trzech rodzajów pożywek do formowania kalusa embriogenicznego: KE1, KE2, KE3. Pożywki o składzie dobranym indywidualnie do odmian i charakteryzujące się odpowiednio różniącym się stężeniem regulatorów wzrostu.
- Pasaż po ok. 40 kalusów na pożywki KE1, KE2, KE3 (9 kombinacji zgodnie z Schematem 2), po 5 kalusów na szalkę, kultura trwająca 2 tygodnie. Kultura prowadzona w ciemności w 23 ºC.
- Ponowne przygotowanie trzech rodzajów pożywek do formowania kalusa embriogenicznego: KE1, KE2, KE3.
- Pasażowanie po ok. 40 kalusów na pożywki KE1, KE2, KE3 (9 kombinacji zgodnie z Schematem 2), po 5 kalusów na szalkę, kultura trwająca kolejne 2 tygodnie, w słabym świetle w 23 ºC.
Etap IV: Regeneracja roślin
- Przygotowanie pożywek do regeneracji roślin: R1, R2. Podobnie jak wyżej o odpowiednio indywidualnie dobranym składzie.
- Pasażowanie po 20 kalusów danego genotypu na pożywki R1, R2 (18 kombinacji zgodnie z Schematem 2), po 5 kalusów na szalkę, kultura trwająca 2 tygodnie, w kontrolowanych warunkach, w pokoju kultur roślin, utrzymując 16 godzinny fotoperiod, w świetle o natężeniu 65–70 μE m-2·s-1 i temperaturze 23 ºC.
- Przygotowanie świeżych pożywek R1, R2 i ponowne przekładanie kalusów na świeże pożywki R1, R2 (zgodnie z Schematem 2), po 5 kalusów na szalkę, kultura trwająca kolejne 1-2 tygodnie
- Przekładanie rozwijających się roślinek na świeże pożywki R1, R2 i ukorzenianie. Przekładanie do pożywki ½ MS i wzmacnianie przed wysadzeniem.
Etap V: Ocena, charakterystyka sekwencji pożywek użytych do kultury in vitro w kontekście wydajności regeneracji.
Oczekiwany efekt końcowy:
Procedura regeneracji in vitro indywidualnie dobrana dla każdego z testowanych genotypów jęczmienia ozimego.