Zadanie 4.7
| Tytuł projektu: | Opracowanie wysokoprzepustowego systemu ukierunkowanej mutagenezy żyta (Secale cereale L.) i jęczmienia (Hordeum vulgare L.). |
| Kierownik projektu: | dr J. Groszyk |
Cel zadania: jest uzyskanie linii żyta (Secale cereale L.) i jęczmienia (Hordeum vulgare L.) z wprowadzonym genem kodującym białko Cas9. Linie te posłużą do indukowania precyzyjnych mutacji z wykorzystaniem wirusowego systemu zawierającego sgRNA, co umożliwi zwiększenie efektywności uzyskiwania roślin o pożądanych cechach, np. plonotwórczych.
Rozdzielenie funkcji katalitycznej od naprowadzającej w systemie CRISPR/Cas9, w połączeniu z wysoką skutecznością systemów wirusowych w porównaniu do konwencjonalnych metod edycji genów opartych na CRISPR/Cas9, pozwala na:
- ominięcie genotypowo-specyficznej zależności regeneracji roślin w kulturach in vitro;
- wyeliminowanie czasochłonnego procesu transformacji genetycznej oraz przyspieszenie wprowadzania kierunkowych mutacji w materiałach hodowlanych;
- zwiększenie efektywności edycji i łatwiejsze uzyskiwanie mutacji wielokrotnych. Wirus BSMV, który zostanie zastosowany w tym zadaniu, był wcześniej zastosowany w technologii VIGS w życie (Groszyk i wsp., 2017), co potwierdza możliwość jego zastosowania w proponowanym układzie eksperymentalnym. Optymalizacja tego systemu dla żyta i jęczmienia otwiera szerokie perspektywy dla wdrażania technik NGT w tworzeniu nowych genotypów zbóż z ulepszonymi cechami, w znacznie krótszym czasie niż przy użyciu klasycznych metod Agro-transformacji i kultur in vitro. Do weryfikacji skuteczności sytemu posłużą geny o dobrze poznanej funkcji, związane z cechami plonotwórczymi, takie jak Calmodulin binding protein GW5 (Liu i wsp., 2017) i Panicle Number And Grain Size (PANDA) (Mao i wsp., 2022).
Zadanie to będzie realizowane poprzez:
- Uzyskanie linii żyta i jęczmienia z wysoką ekspresją genu Cas9.
- Selekcja genotypów żyta ozimego dostarczonych przez polskie spółki hodowli roślin pod kątem możliwości transformacji, regeneracji i plenności.
- Optymalizacja procedury transformacji i regeneracji poprzez zastosowanie czynników zmieniających wzór metylacji.
- Optymalizacja stadium rozwojowego żyta i jęczmienia przeznaczonego do inokulacji wirusem zawierającym sgRNA.
- Określenie ekspresji genu kodującego Cas9 oraz ilości białka Cas9 w liniach transgenicznych jęczmienia uzyskanych w wyniku