Zadanie 4.3
| Tytuł projektu: | Adaptacja zawiesin komórkowych żyta i jęczmienia do systemu oceny konstruktów CRISPR/Cas9 oraz opracowanie mapy dostępności chromatyny dla zwiększenia efektywności edycji genomu jęczmienia. |
| Kierownik projektu: | dr K. Michalski(Radz.) |
Szczegółowy opis zakresu rzeczowego zadań w 2023r.:
Drugim głównym celem jest opracowanie porównawczej mapy dostępności chromatyny dla komórek zawiesiny i niedojrzałych zarodków jęczmienia, co umożliwi dalszą walidację opracowywanego systemu.
Opracowane w roku bieżącym narzędzia, stanowić będą spójny element większego systemu, służącego kompleksowej i wysokoprzepustowej ocenie konstruktów genetycznych do edycji genomów roślinnych. W perspektywie kolejnych 4 lat możliwe będzie rozszerzenie proponowanego systemu o kolejne, powszechnie uprawiane w Polsce gatunki zbóż. Ponadto, przewiduje się wytworzenie i optymalizację wariantów systemu zawiesinowego służących nie tylko ocenie aktywności natywnej nukleazy Cas9, ale także jej białek pochodnych, służących edycji precyzyjnej – tj. Base Editing i Prime Editing.
W bieżącym roku planowane jest dalsze rozszerzenie systemu oceny opartego o zawiesiny komórkowe zbóż. Przygotowane zostaną transformowane zawiesiny żyta oraz jęczmienia, wykazujące stabilną ekspresję białkowego komponentu nukleazy – Cas9. Analogicznie do roku poprzedniego, posłużą one opracowaniu oraz walidacji wydajnego systemu oceny nowych sekwencji gRNA w tych gatunkach. Do walidacji nowych komponentów systemu wykorzystane zostanie 6 sekwencji gRNA wskazanych przez wykonawców zadania 4.2. Uzyskane wyniki zostaną wykorzystane do odpowiedniego doboru konstruktów do stabilnej transformacji roślin zaplanowanych w zadaniu 4.2.
Dodatkowo planowane są doświadczenia oparte o sekwencjonowanie nowej generacji (ATAC-Seq) mające na celu opracowanie mapy chromosomowej, wskazującej na dostępność chromatyny do edycji opartej o CRISPR/Cas9. Zaplanowane doświadczenia pozwolą na porównanie profili dostępności chromatyny w komórkach pochodzących z zawiesiny komórkowej (rozwijany model badawczy) oraz niedojrzałych zarodków, które używane są w zadaniu 4.2 jako materiał wyjściowy do stabilnej transformacji zbóż. Jako model do tego doświadczenia wybrano jęczmień. Jest to gatunek diploidalny, co ułatwi wstępne analizy. W kolejnych latach projektu możliwe będzie przygotowanie podobnych map dla innych gatunków zbożowych.
Opracowane mapy, pozwolą na stwierdzenie w jakim stopniu ocena konstruktów CRISPR/Cas9 w zawiesinach komórkowych znajdzie odzwierciedlenie w modyfikacjach genetycznych komórek niedojrzałych zarodków. Ponadto, mapa dostępności chromatyny dla niedojrzałych zarodków jęczmienia sama w sobie stanowić będzie narzędzie przydatne dla efektywnego doboru regionów chromosomowych do wydajnej edycji w tym gatunku.